【客户文献】一管完成SNP分型！cliCRISPR突破CRISPR检测瓶颈
单核苷酸多态性（SNP）是人类最常见的遗传变异形式，与多种疾病相关。传统的SNP分型方法（如PCR和测序）依赖专业仪器和操作人员，不适合现场筛查。CRISPR/Cas12a检测虽可在常温下进行，但其反式切割的非特异性导致难以直接区分野生型、突变型和杂合型。 近期，郑州大学玉崧成团队在Biosensors and Bioelectronics上发表了题为cliCRISPR: crRNA-limited CRISPR/Cas12a system for multiplexed detection的论文，研究提出了一种crRNA限制性策略，可在单一反应管中顺利获得比较荧光强度直接实现SNP全分型，无需物理分离、实时动力学监测或复杂数据处理。 EVO视讯 EVO真人生命基因有幸为其给予高性能Cas12a蛋白，助力研究取得进展。 原文链接：http://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117834 文章亮点 1. 创新性crRNA限制策略，突破多重检测瓶颈： 研究团队第一时间验证了FEN1酶对野生型与突变型序列的特异性切割能力，并顺利获得凝胶电泳确认切割产物P1、P2可作为SDA的有效引物。 进一步实验表明，设计的crRNA1和crRNA2能分别引导Cas12a识别T1与T2，并激活反式切割活性。 在靶标过量的情况下，荧光强度随crRNA浓度增加而升高，且在crRNA1为10 nM、crRNA2为2 nM时，T1与T2产生的信号差异显著，成功实现三种基因型的区分。
图 1. crRNA限制性CRISPR/Cas12a检测体系的可行性验证 顺利获得系统优化，确定最佳反应条件为： 图 2. 关键组分与反应参数优化结果 基于逻辑门策略，顺利获得设定阈值V₁与V₂，将荧光斜率划分为三个区间，分别对应GG、AA与GA基因型。该方法在5分钟内即可实现稳定、重复的动力学曲线分离。 特异性验证显示，非靶标序列（Random1–5）均未引起显著干扰，表明方法具备高特异性与稳定性。 图 3. 分型策略、动力学曲线与特异性验证 在10例来自两个家庭的样本中，cliCRISPR系统成功识别出AA与GA基因型，结果与TaqMan qPCR方法完全一致，并符合孟德尔遗传定律。所有样本的重复性良好，证实该方法在实际应用中的准确性与可靠性。 图 4.实际样本分型结果与家系验证 cliCRISPR系统顺利获得crRNA限制策略与逻辑门阈值的结合，突破了传统CRISPR/Cas12a系统在多重检测中的瓶颈，实现了无需物理分离、一管完成的SNP精准分型。 该方法在rs4646536分型中与金标准qPCR高度一致，并具备操作简便、成本低廉、结果直观等优势，为现场快速基因分型与精准预防给予了有力工具。 未来，可顺利获得优化扩增特异性、缩短总检测时间，将其拓展至更多SNP位点的临床应用。 EVO视讯 EVO真人生命基因拥有自主研发蛋白质表达纯化平台，经活性测试本公司的Cas酶产品活性明显优于市面上其他的酶，真正实现高纯度、高活性、高灵敏度酶产品的制备。更有恒温快速扩增试剂盒、CRISPR检测试剂盒现货，设备要求低，反应时间短，下单即达！
顺利获得控制不同crRNA的浓度，将荧光信号强度与crRNA浓度而非靶标浓度关联，从而在单一反应管内成功区分野生型、突变型和杂合型三种基因型。
2. “逻辑门”判读策略，实现简单、精准分型：
研究引入了一套基于荧光强度斜率的“逻辑门”判读策略。顺利获得设定两个明确的阈值（V₁和V₂），将陆续在的荧光信号转化为离散的基因型结果（GG/AA/GA）。
3. 临床验证充分，展现强大应用潜力：
该方法在来自真实家庭的临床样本中进行了验证，其分型结果与金标准TaqMan qPCR方法达到100%一致，并且所有结果均符合孟德尔遗传定律。
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