【干货分享】CRISPR检测保姆级攻略，实验前必看！
CRISPR检测
CRISPR检测技术是基于CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔短回文重复序列）技术的原理而开展出的一种检测手段，Cas蛋白识别靶标核酸，Cas蛋白的反式切割活性将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成靶标核酸检测的过程。
该技术利用CRISPR-Cas系统的特异性识别与附属切割能力，实现对目标DNA或RNA序列的高效、快速、灵敏检测。CRISPR检测具有多项显著优势，包括高灵敏度、高特异性、经济实用等，在环境检测、动物疫病、疾病监测、宠物疾病、食品安全等多个领域得到了广泛应用。
小艾同学整理了CRISPR检测的干货知识点，希望能帮助到你。
Cas酶在CRISPR检测中扮演着至关重要的角色，它能精准地识别并切割与目标序列互补的DNA或RNA，从而实现对特定基因的高效检测。由于实验目的、靶标基因、操作条件等的不同，选择合适Cas酶尤为重要。
• Cas12a：又称Cpf1，它是一种核酸内切酶，能特异性识别dsDNA上的PAM（5'-TTTV-3'）位点，切割靶标dsDNA。使DNA双链断裂并生成黏性末端；对单链DNA（ssDNA）靶标的识别和剪切不依赖PAM序列。
• Cas12b：一种依赖sgRNA介导的核酸内切酶，能特异性识别并剪切带PAM（5’-TTV-3）的dsDNA，使DNA双链断裂并生成黏性末端。特别的是，它在45-65摄氏度的中高温环境中具备更高的切割活性。
• Cas13a：在sgRNA引导下，可以识别并切割体系中的特异单链RNA。在切割特定RNA序列后，其“附属切割”活性会被激活，可高效地切割体系中任意序列的ssRNA。
EVO视讯 EVO真人生命基因自主研发蛋白质表达纯化平台，已取得高纯度、高活性、高回收率的Cas12/Cas13酶，检测限可达amol级别
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Cas蛋白 |
识别靶标类型 |
PAM/PFS |
备注 |
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LbCas12a |
DNA |
5’TTTV |
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AapCas12b |
DNA |
5’TTV |
酶最适温度较高（40℃-60℃适合于LAMP联用） |
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LwaCas13a |
RNA |
PFS-3’A、U、C |
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LbuCas13a |
RNA |
PFS-3’A、U、C |
荧光背景信号低 |
crRNA是CRISPR-Cas系统中的一个关键组成部分，它识别并引导Cas蛋白到目标核酸序列位置，顺利获得与目标DNA或RNA序列的互补配对，指导Cas蛋白进行精确的切割或编辑。crRNA极大影响检测体系的灵敏度，因此在实验中我们需要设计多条crRNA进行体外切割测试，选择效果最优的crRNA。
crRNA设计合成的注意事项：
1. 目标序列选择：通常是根据目标基因的功能和相关研究的需要来确定。分型检测则选择型间特异的基因作为靶标，通用检测则选择型间保守的基因作为靶标。
2. PAM序列选择：根据序列情况优先选择经典PAM序列，其次选择次优PAM序列。
3.
4. 避免剪切位点：避免剪切位点与其他非目标基因席列相匹配。这可以顺利获得使用序列比对软件来实现。
5. 避免剪切位点的二级结构：避免目标序列和其他非目标序列形成稳定的二级结构。
6. crRNA的评估与验证：在设计过程中，可以使用序列比对工具和结构预测工具来评估设计的crRNA的特异性和有效性，最后顺利获得实验证实该crRNA的特异性和剪切效果。
以下是我们常用的crRNA引物设计序列：
1) LbCas12a:
5'AAUUUCUACUAAGUGUAGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'(N表示与特导靶标序列互补配对的spacer区)
2) AapCas12b：
5'GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCU
UCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'，(N表示与特导靶标序列互补配对的spacer区)
3) LwaCas13a：
5'GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'，(N表示与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20-28nt)
4) LbuCas13a：
5'GGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'，(N表示与特异靶标序列互补配对的spacer区)
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03 恒温扩增体系选择
恒温扩增技术（Isothermal Amplification）是实现快速、精确检测的关键方法之一。相比传统的PCR方法，它更加简便和快速，特别是在需要现场快速检测或设备条件有限的情况下，具有独特的优势。下面为大家介绍一下常见的恒温扩增体系。
1. LAMP（环介导等温扩增）
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特点：LAMP技术依赖于一组特制的引物和Bst DNA聚合酶的特异性裂解活性，能在一个恒定的温度（通常是60°C-65°C）下进行。这个方法能在短时间内（一般小于一个小时）高效地进行扩增，并且可以顺利获得肉眼观察扩增结果（如加入荧光剂）。
2. RPA（重组酶聚合酶扩增）
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特点：该技术在室温或接近室温条件（37°C-42°C）下工作，无需特殊设备。RPA顺利获得重组酶解开双链DNA，可在较短时间内完成目标DNA的扩增。
3. NASBA（核酸序列依赖的扩增）
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特点：NASBA反应在恒温条件（41°C-42°C）下进行，扩增的产物可以是单链DNA或双链RNA；可以检测到较低浓度的RNA靶标，但对试剂的稳定性要求较高，且操作相对复杂。
在选择恒温扩增体系时，需要综合考虑多种因素，包括：实验目的、目标序列特性、实验条件、以及扩增体系的稳定性和效率等。以下是在选择恒温扩增体系时需考虑的两大重要因素：
I. 目标序列特性：目标序列的长度、GC含量、是否存在二级结构等因素都会影响到恒温扩增的效果。因此在选择恒温扩增体系时，需要充分分析目标序列的特性，并选择适合该特性的扩增体系。
II. 扩增体系的稳定性和效率：恒温扩增体系的稳定性和效率是选择时需要考虑的重要因素。稳定的体系可以减少实验误差，提高结果的准确性；高效的体系可以缩短实验时间，提高实验效率。
CRISPR检测作为“下一代分子诊断技术”，召开实验前，选择合适的Cas酶、最佳的crRNA序列以及恒温扩增体系，对后续实验的特异性与灵敏度影响重大。
非洲猪瘟病毒检测
结果:
使用ASFV 1070检测非洲猪瘟病毒，CRISPR/Cas12a一管法检测技术可在10min内检测到100 copies的核酸;可在20min内检测到10-50 copies的核酸。
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EVO视讯 EVO真人生命基因基于CRISPR检测开发的高灵敏度、高特异性、快速恒温核酸检测技术——FASST快速检测技术，解决了传统CRISPR检测中存在的问题，如操作复杂、易污染、灵敏度低和耗时长。顺利获得自主开发的蛋白质纯化平台优化Cas酶结构，开发特有的crRNA设计逻辑，生产高效crRNA，并使用自主设计的reporter，实现更高灵敏检测，简化操作步骤，减少污染风险。可根据您的实验需求选择：分步定制或全套定制检测服务。
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