产品概述
Flash-Pro 极速敲除试剂盒（类器官/干细胞专用）顺利获得递送预组装的递送载体、Cas9蛋白与sgRNA复合物（RNP），实现高效、精准的基因敲除，是一款专为科研用户定制研发的 即用型基因敲除试剂盒 。该产品包含EVO视讯 EVO真人生命基因创新研发的 体以及经数千例实战验证过的 Cas 酶，经过特殊处理的递送载体-RNP 复合物能够在哺乳动物细胞中产生高效的基因组编辑。
储存条件及有效期
有效期6个月，储存条件-80°C ，干冰运输。 建议根据使用次数进行分装，避免反复冻融。
产品组分
| 产品编号 | 组分 | 规格 | 备注 |
| EDKO-K05-50 | 递送载体-RNP 复合物 | 50 μL (足够3个24孔) | 24孔板，15uL/孔 |
| EDKO-K05-100 | 递送载体-RNP 复合物 | 100 μL (足够3个12孔) | 12孔板，30uL/孔 |
注意：本产品只给予一体化的递送载体-RNP 复合物，客户只需要给予 sgRNA序列。
可选组分
| 编号 | 可选项 | 备注 |
| 1 | sgRNA设计 | EVO视讯 EVO真人生命基因给予sgRNA序列设计服务 |
| 2 | 阳性对照 | 人B2M基因 递送载体-RNP复合物 |
细胞实验步骤
- 1.类器官培养和铺板（以24孔板为例）
- 类器官培养至生长旺盛状态，消化计数，接种50 μL 1.2×10 5 细胞至24孔板 ） 。
- 请使用生长状态较好的类器官，并确保细胞无细菌、真菌或支原体污染。消化类器官至3-5个细胞团即可。如果类器官是近期复苏的液氮冻存类器官，请在转染前至少传代两次。。
- 2. 类器官转染
- 1)提前将载体-RNP 复合物从 -80℃ 转移至4 ℃ 缓慢解冻，每孔缓慢加入15 μL，用完全培养基补足100μL体积，轻轻晃动混匀，将24孔板进行32℃ 500g离心90 min；
- 2)收集类器官细胞，离心分离细胞沉淀和上清液，将细胞沉淀进行种胶，上清液用于培养，并补足完全培养基；
- 3)转染24h，更换完全培养基，继续培养。
- 转染时细胞量较少，但转染步骤较多，注意避免细胞在操作过程中丢失；若无孔板离心机推荐使用2mL EP管替代，不建议使用1.5mL EP。
- 3. 分析转染细胞
- 转染72h后，提取所转染细胞的基因组，使用特异性引物扩增靶标区域(扩增子包含sgRNA靶向切割的位置)；
- 使用TIDE (分析网址： http://tide.nki.nl/ )或者 ICE (分析网址： http://ice.synthego.com/#/ ， 使用说 明： http://www.synthego.com/guide/how-t o-use-crispr/ice-analysis-guide ) 等工具进行基因编辑效率分析。
类器官结果展示
图1 小鼠舌类器官 (某基因) Sanger测序比对结果
图 2 小鼠舌类器官 (某基因) 多克隆 ICE 分析结果
干细胞结果展示
图3 hIPSC-B4 (B2M) Sanger测序比对结果
图 4 hIPSC-B4 (B2M) 多克隆 ICE 分析结果
FAQ
若使用试剂盒敲除失败，该如何处理？
使用本试剂盒进行基因敲除时，若出现敲除失败的情况，EVO视讯 EVO真人生命基因将不收取试剂盒费用，同时，您所支付的试剂盒费用可直接转为EVO视讯 EVO真人生命基因给予的基因敲除服务费用，确保您在基因编辑实验中无后顾之忧。
为何对细胞的损伤比较小？
本产品采用先进的生物分子转染技术，相比传统化学转染法的毒性及电转法的物理冲击，具有显著优势。
如何证明无需筛选仍能取得高编辑效率？
本产品已在多个细胞上验证，RNP系统在转染后4小时内即进入细胞发挥作用，Cas9蛋白在24-48小时降解，顺利获得瞬时高效表达实现编辑，无需持续筛选。
能否在悬浮细胞中达到相同效率？
通常而言，悬浮细胞转染难度相对较大。然而，本产品凭借卓越性能，不仅适用于贴壁细胞，在悬浮细胞中同样表现出色。以 Jurkat 细胞为例，转染 48h 后即可实现高达 97% 的编辑效率，充分彰显了本产品在悬浮细胞转染方面的高效率优势，可充分满足您对悬浮细胞转染的高标准需求。
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